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活性氧检测试剂盒  DCFH-DA 
货号：CA1410 
规格：100-500T
活性氧检测试剂盒  DCFH-DA内容：
A 液 DCFH-DA（10 mM） 0.1 ml -20 ºC 保存
B 液 活性氧阳性对照（Rosup, 50mg/mL ） 1 ml -20 ºC 保存
说明书 1 份
活性氧检测试剂盒  DCFH-DA简介：
活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测 的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF 。检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂 Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup 是一种混合物，浓度为 50mg/mL 。
本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。
本试剂盒可以测定 100～500 个样品。
活性氧检测试剂盒  DCFH-DA操作步骤：
一、装载探针：
对于刺激时间较短（通常为 2 小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药 物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为 6 小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药 物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：
本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照 1 ∶1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓 度为 10μ mol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1mL 。37℃细胞培养箱内孵育 20 分钟。用无血清 细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞 20～30 分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：
按照 1 ∶1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为 10μmol/L。细胞收集 后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为一百万至二千万/mL ，37℃细胞培养箱内孵育 20 分钟。每隔 3 ～ 5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞 内的 DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。 通常活性氧阳性对照在刺激细胞 20～30 分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明：仅在阳性对照孔中加入 Rosup 作为阳性对照，其余孔不必加入 Rosup。
二、检测：
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶 标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪 检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
三、参数设置
使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱 和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF 。DCF 的激发光谱和发射光谱参考下图。

其它说明：
阳性对照可以按照 1 ∶1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共 1mL ，可以加入 1 μ L 的阳性对照 刺激。通常刺激后 20～30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照 的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30 分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的 浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1 ∶2000～1 ∶5000 稀释 DCFH-DA，使装载探针时 DCFH-DA 的浓度为 2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在 15～60 分钟内适当进行调整。
活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
保存条件：
-20 ℃避光保存，有效期一年。
注意事项：
1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况 是否良好。DCF 的激发光谱和发射光谱请参考上图。
3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
相关文献：
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