产品简介

Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit 活力/细胞毒性测定试剂盒含两种荧光染料 DMAO 和 EthD-III， 可分别将活细菌染成绿色 ，将死细菌染成红色。

DMAO 是一种绿色核酸荧光染料 ，可染色活细菌和死细菌。EthD-III 是一种红色核酸荧光染料 ，仅染色细  胞膜受损的死细菌。将 DMAO 和 EthD-III 混合对细菌进行染色时 ，具有完整细胞膜的活细菌呈现绿色 ，而 具有受损细胞膜的死细菌呈现绿色和红色。通过荧光显微镜或流式细胞仪等来分析染色后的细菌 ，以此判 断细菌的活死状态。适用于大多数细菌类型。

细菌活力通常指细菌在合适的培养基中繁殖的能力 ，对其的测定称为生长测定。该试剂盒与在液体或固体 培养基中进行的细菌生长测定结果具有较好的一致性。但在某些条件下 ，膜损伤的细菌可能会在营养培养 基中恢复并繁殖 ，而这些细菌在试剂盒测定中可能会被判为死亡。相反 ，一些具有完整膜的细菌可能无法 在营养培养基中繁殖 ，但这些细菌在试剂盒测定中可能被判为存活。因此 ，如果发现该试剂盒检测和细菌 生长测定之间有相当大的差异 ，应该考虑上述可能性。

光谱特性 DMAO： Ex/Em=503/530nm（with DNA） ；EthD-III：Ex/Em=530/620nm（with DNA）

组分信息

储存条件

冰袋运输。储存于 4ºC ，至少可以储存 6 个月。

注意事项

1.     为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.     本产品仅用于科研。

使用说明

1.     活、死细菌样品对照制备（可选）

1)     在液体培养基中培养 4 mL 的细菌至晚期对数期。

2)     在 EP 管中准备两份 1 mL 的细菌液 ，并在 5,000-10,000g 条件下离心 10-15 min。

3)     去除上清液 ，在其中一支 EP 管中加入 0.3 mL 的 0.85% NaCl 重悬细菌 ，在另一管中加入 1 mL 的

0.85% NaCl 重悬细菌。 

4)     在含有 0.3 mL 的 0.85% NaCl 的管中加入 0.7 mL 异丙醇 ，充分混合（最终浓度为 70% 的异丙醇） 用以制备死细菌样品。

5)     将两种样品在室温下孵育 1 h ，每 15 min 混合一次。

6)     两种样品在 5,000-10,000g 条件下离心 10-15 min。

7)     去除上清 ，在两种样品中加入 1 mL 的 0.85% NaCl 重悬细菌 ，并如步骤 6 再次离心。

8)     使用分光光度计测定两种菌悬液在 670 nm 处的吸光值（OD670）。

9)     将两种菌悬液（活的和死亡的）密度调整到 108 个细菌/ mL（OD670≈0.3） ，然后用 0.85%  的 NaCl 以 1：100 稀释 ，使最终密度为 106 个细菌/ mL。

10)   如下表所示混合两种菌悬液以获得所需的活细胞：死细胞比率。

表 1 活、死菌悬液按一定体积混合以达到所需的活细胞、死细胞比例

2.     荧光显微镜的染色方法

1)     将 1 体积的 DMAO 和 2 体积的 EthD-III 在微量离心管中混合，充分混合后加入 8 体积的 0.85% NaCl 溶液以得到 100×染料溶液。

2)     每 100  μL 菌悬液 ，加 1  μL 的 100×染料溶液。

3)     充分混合 ，室温下在黑暗中孵育 15 min。

   4)     取 5  μL 染色后的菌悬液滴在带有 18 mm 方形盖玻片的载玻片上。

5)     在荧光显微镜下观察。活细菌和死细菌的荧光可以在任何标准的 FITC 长效过滤器下同时观察到。或

者 ，活的（绿色荧光）和死的（红色荧光）细菌可以分别用 FITC 和 Cy3（或 TexasRed）通道观察。

注意：

1)     在对细菌染色之前，必须注意去除残留的生长介质。核酸和其他培养基组分可以某种方式结合 DMAO 和 EthD-III 染料，导致不可接受的染色变化。简单的洗涤步骤通常足以从细菌悬浮液中除去干扰介质 组分。不建议使用磷酸盐缓冲液 ，因为它们会降低染色效率。

2)     在开始正式实验前应调节染料浓度来使 DMAO 标记活细菌、使 EthD-III 标记死细菌进行区分。最佳浓 度可能因细菌菌株的不同而异。一般最好使用能够提供充足信号的最低染料浓度。

3.     细胞流式的染色方法

实验开始前 ，请阅读荧光显微镜染色步骤下的注意事项。

1)     根据表 1 ，在 EP 管中加入 11 种不同比例的活细菌和死细菌。11 种样品中每种的体积 1 mL。

2)     将 12  μL 的 DMAO 储备溶液与 24  μL 的 EthD-III 储备液在微量离心管中混合。11 个样品中的每个加 入 3  μL 的混合染料 ，通过上下吹打几次彻底混合。（注意：需要准备另外的对照细菌样品用于单独 的 DMAO 和单独的 EthD-III 染色）

3)     室温下在黑暗中孵育 15 min。

4)     使用流式细胞仪分析每个样品，使用 DMAO 阳性细胞的 FITC 通道和 EthD-III 阳性细胞的 PI 或 PE 通 道。